NEUROBLASTOMA
Luigi Cuccurullo

 

I tumori neuroectodermici primitivi del Sistema Nervoso Centrale sono un gruppo eterogeneo di neoplasie le quali sono costituite da aggregati di cellule neuroepiteliali aventi una morfologia indifferenziata o scarsamente differenziata; questi elementi, proliferando, possono acquisire i caratteri citologici orientati in senso neuronale, astrocitario o ependimale (WHO).
Di questi elementi, quelli che acquisiscono i caratteri in senso neuronale prendono il nome di neuroblastomi; nei casi in cui   questa popolazione , formata da neuroblasti , si rivela essere commista a cellule gangliari la neoplasia prende il nome di ganglio-neuroblastoma.
I neuroblastomi si possono localizzare a livello degli emisferi cerebrali,  della regione soprasellare, del midollo spinale (neuroblastomi centrali); oppure si possono manifestare a carico dei gangli del sistema nervoso simpatico e della midollare del surrene (neuroblastomi periferici).
In particolare, i neuroblastomi localizzati a livello degli emisferi cerebrali hanno una posizione nosografica peculiare poiché, secondo la nosografia sistematica, sono considerati facenti  parte del gruppo dei tumori embrionali sopratentoriali (CNS-PNET), assieme ai medullo-epiteliomi (riconoscibili per la presenza di microstrutture simili al tubo neurale), agli ependimoblastomi (identificabili per la presenza di rosette vere) e ai tumori embrionali non altrimenti classificabili (W.H.O.).
Tutta la letteratura dedicata allo studio e alla diagnostica dei neuroblastomi centrali e periferici riconosce la necessità di ricerche interdisciplinari di morfologia, di genetica e di biochimica; i risultati acquisiti devono essere integrati e interpretati  tenendo conto  del quadro clinico-anamnestico, per  poter stabilire un valido giudizio prognostico e programmare un mirato schema terapeutico.
Questo scritto non potrà riassumere i risultati acquisiti  nei settori scientifici dianzi ricordati, ma farà un   breve riferimento  solo ai dati di  morfopatologia  acquisibili mediante le tecniche di istologia, di immunoistochima  di microscopia elettronica.
Queste metodologie per  cogliere tutte le possibili varietà del polimorfismo  dei neuroblastomi  richiedono il  prelievo di numerosi frammenti da zone diverse della neoplasia e la applicazione, accanto ai criteri qualitativi, anche quelli semi-quantitativi.

A) CARATTERI MACROSCOPICI

All’esame macroscopico i neuroblastomi del S.N.C. si presentano come una massa di dimensioni variabili, in rapporto all’epoca di osservazione , hanno un aspetto compatto e mostrano frequentemente limiti indistinti per la esistenza di processi infiltrativi nei tessuti circostanti. La consistenza è molliccia, il colore è grigio-chiaro o grigio-rossastro per fenomeni di congestione. La consistenza può aumentare e il colore può virare verso il grigio-biancastro se nel contesto della neoplasia si è sviluppato una quota cospicua di fibre collagene; in questi casi il neuroblastoma viene definito come neuroblastoma desmoplastico. Questi caratteri macroscopici possono subire modificazioni o essere sovvertiti per il sovrapporsi di edema,di flogosi, di focolai emorragici,e di estese necrosi; nei casi in cui questi processi sono molto ampi, destrutturanti e tra loro confluenti si possono instaurare escavazioni multiple e di varia grandezza.

B ) CARATTERI ISTOPATOLOGICI

Al microscopio luce si rileva che i neuroblastomi sono costituiti (a seconda degli istotipi) da una componente neoplastica di tipo neuroblastica-ganglionica, da cellule stromali specifiche non neoplastiche indicate come cellule stromali schwanniche,e da stroma aspecifico con vasi.

1 CELLULE NEUROBLASTICHE

Le cellule neuroblastiche  sono di piccole dimensioni, hanno forma rotondeggiante od ovalare, sono fornite di un esiguo orletto citoplasmatico eosinofilo od amfofilo e sono occupate da un nucleo ipercromatinico, compatto, di forma sferoidale.
Questo monomorfismo, considerato abituale, può essere modificato dalla presenza di  cellule giganti uni o multinucleate, di elementi sinciziali o pleomorfi,oppure dal riscontro di nuclei irregolari, bizzarri aventi spesso nel loro interno inclusi di materiale citoplasmatico.
La disposizione spaziale di queste cellule può essere di tipo diffuso-informe, oppure essere riunite a formare filiere parallele separate da sottili strie stromali, o ancora essere organizzate in modo da disegnare un profilo retiforme,e, non ultimo  reperto, essere raccolte a guisa di   piccole formazioni  pseudonodulari; accanto e oltre questi abbozzi strutturali è frequente il riscontro anche di cellule isolate o riunite in piccoli gruppi dispersi  nello stroma.
Le cellule neuroblastiche possono presentare  caratteri morfologici di differenziazione; questi sono di vario grado  e  si manifestano attraverso un aumento volumetrico del corpo cellulare,  un maggiore sviluppo della quota citoplasmatica, la esistenza di un nucleo vescicoloso contenente un nucleolo prominente, la presenza di neuropilo in sede intercellulare e  la possibile formazione di pseudo-rosette o di rosette di Homer-Wright.
Una particolare attenzione è stata dedicata alla morfologia dei nuclei dei neuroblasti per ottenere indicazioni circa il grado della aggressività biologica  del tumore. A tal fine sono state valutate la volumetria, la forma, la disposizione della cromatina, la molteplicità dei nuclei la prominenza dei nucleoli e in particolar modo la loro attività mitotica tipica e atipica.
Questa attività mitotica viene calcolata , secondo criteri semiquantitativi, sulla base del numero dei nuclei in mitosi e di quelli colpiti dal processo di Karioressi; questa valutazione viene eseguita effettuando la conta di nuclei mitotici-Karioressici  su 5000 nuclei  esaminati; il risultato così ottenuto  viene letto e   interpretato secondo una tabella  indicizzata  denominata   “Indice Mitotico-Karioressico” (MKI);  questo indice contribuisce a fornire  indicazioni circa   il grado di aggressività del neuroblastoma e viene scansionato secondo i seguenti 5 livelli:
Indice lieve (meno di 100 nuclei  mitotici-Karioressici su 5000 esaminati)
Indice medio (100-200 nuclei mitotici-Karioressici  su 5000 esaminati)
Indice alto (superiore a 200 nuclei mitotici-Karioressici su 5000 esaminati)
Indice indeterminato      
Indice non valutabile         

Nel contesto dei neuroblastomi sono frequenti i processi regressivi; questi colpiscono in prevalenza la componente cellulare neuroblastica e sono rappresentati da vacuolizzazione citoplasmatica,da necrosi, da emorragie e da focolai di calcificazione. Quest’ultimo reperto   viene considerato importante per il calcolo del grado di  aggressività del tumore e pertanto viene  interpretato secondo il seguente schema: a) I focolai di calcificazione sono presenti; b) i focolai di calcificazione non sono identificabili; c) i focolai di calcificazione non sono valutabili.

 

2 CELLULE GANGLIARI         

La seconda componente neoplastica, presente in alcuni istotipi di neuroblastomi è data dalle cellule gangliari.
Questi elementi sono voluminosi, hanno ampio citoplasma eosinofilo e sono centrati da un nucleo vescicoloso con nucleolo  prominente; frequentemente si repertano anche cellule gangliari atipiche, di volume gigante, di forma irregolare, mononucleate, bi-nucleate ,o multinucleate.
E’ stata documentata una continuità maturativa tra le cellule neuroblastiche e quelle gangliari; infatti è possibile il riscontro di elementi di transizione tra i due citotipi e alla stessa maniera è possibile rilevare diversi livelli di differenziazione delle cellule gangliari fino al reperimento di cellule gangliari mature con abbozzo di neurite e ben sviluppato neuropilo.
Anche le cellule ganglioniche possono essere sede di processi regressivi citoplasmatici e nucleari o possono essere travolte da processi necrotico-emorragici con scomparsa parziale o subtotale  di questa componente cellulare assieme a quella neuroblastica.
La suddetta componente neuroblastica ,considerata sia sotto il profilo maturativo sia sotto quello quantitativo,   associata  alle quote di cellule gangliari nei loro livelli di differenziazione, ha consentito di tracciare  la seguente classificazione morfologica dei neuroblastomi:
Neuroblastoma indifferenziato
Neuroblastoma scarsamente differenziato
Neuroblastoma differenziato       
Ganglioneuroblastoma
Ganglioneuroma

 

3 CELLULE STROMALI SWANNCHE

Il patrimonio cellulare dei neuroblastomi è fornito anche da cellule stromali specifiche indicate con il nome di “cellule stromali schwanniche”.
Questi elementi sono piccoli, hanno forma fusata o a virgola, sono forniti di un esiguo orletto citoplasmatico e sono occupati da un nucleo normocromatinico di forma oblunga. Sono facilmente identificabili nel contesto della popolazione cellulare neuroblastica poiché rivelano una immunoespressività per proteina S-100. Sono distribuiti apparentemente in modo casuale negli spazi intercellulari e si dispongono a ridosso delle cellule neuroblastiche.
La loro istogenesi è incerta e su tale tema sono state prospettate diverse ipotesi interpretative; quella maggiormente accreditata ritiene che queste cellule non appartengano al sistema nervoso, né siano di tipo neoplastico ma debbano essere considerate quali elementi “reattivi ,modificati dai neuroblasti”.
Secondo questa teoria, le cellule schwanniche siano atte a svolgere , mediante la secrezione di sostanze trofiche, una azione biologica su i neuroblasti, determinando in essi processi di differenziazione e di proliferazione.
A  sostegno di questa ipotesi , è stato riportato e sottolineato un rapporto proporzionale diretto tra il numero di cellule schwanniche e il grado di differenziazione delle cellule neuroblastiche.
Questa acquisizione dottrinale rappresenta la base  del “SHIMADA SYSTEM” che, opportunamente graduato mediante criteri semiquantitativi ,si articola nei seguenti punti:
1 I neuroblastomi indifferenziati o scarsamente differenziati sono privi o hanno un numero esiguo di cellule schwanniche.
2 I neuroblastomi differenziati hanno un buon numero di cellule schwanniche.
3 I ganglioneuroblastomi sono ricchi di cellule schwanniche.( Attenzione, ridurre lo spazio interlinea
4 I ganglioneuroni sono dominati da cellule schwanniche.

4     CELLULE STROMALI  ASPECIFICHE  E VASI

I neuroblastomi, nella diversità dei loro istotipi, sono forniti anche di un sistema stromale aspecifico e di una rete vascolare.
La componente stromale aspecifica è costituita da fibre collagene, da fibrille precollagene e da fibroblasti; essa è molto variabile poiché può essere circoscritta ai vasi e alle zone perivascolari o svilupparsi sotto forma di tralci variamente orientati e delimitare zone o pseudo-noduli neoplastici.
Nei casi in cui questo stroma è abbondante, la neoplasia viene indicata come neuroblastoma desmoplastico. Anche la componente vascolare è ben sviluppata in conseguenza di processi di angiogenesi; si repertano, infatti, numerosi capillari e vasi di piccolo calibro aventi pareti sottili e semplificate.
Questa rete vascolare è distribuita in modo asimmetrico, irregolare e molto spesso è avvolta da manicotti di cellule neoplastiche, le quali possono infiltrare le pareti e riversarsi nel lume. Frequentemente i capillari sono caratterizzati da endoteli pseudostratificati, iperplastici con riduzione dello spazio endocapillare. In sede perivascolare e negli interstizi dello stroma si possono repertare piccoli focolai di linfociti e monociti .

 

B)  PROFILO IMMUNOISTOCHIMICO

La identificazione immunoistochimica delle cellule neuroblastiche viene raggiunta mediante la immunoespressività della Sinaptofisina, della N.S.E., della LEV-7 e la positività di membrane del CD-44.
La identificazione immunoistochimica delle cellule stromali schwanniche è ottenuta mediante la immunoespressività citoplasmatica per la proteina S-100.
La identificazione della componente stromale aspecifica è realizzata mediante la immunoespressività per la Fibronectina e la Vimentina.
L’indice di attività proliferativa della neoplasia è ricavato dalla densità di immunopositività per la Ki-67.

C) CARATTERI ULTRASTRUTTURALI

Le indagini al microscopio elettronico dei neuroblasti integrano quelle ottenute al microscopio luce,in quanto i reperti ultrastrutturali forniscono nei dettagli informazioni circa i livelli di differenziazione delle cellule.
I neuroblasti indifferenziati mostrano il citoplasma quasi privo di organuli ma fornito di ribosomi e poliribosomi e non presentano  segni  di strutture giunzionali ,
I neuroblasti scarsamente differenziati hanno il citoplasma contenente diversi mitocondri , piccole quote di ergastoplasma, e molti ribosomi. Non si repertano strutture giunzionali.
I neuroblasti differenziati si riconoscono per la presenza di organuli, di neurosecreti, per il riscontro di vescicole intracitoplasmatiche, per la comparsa di abbozzi di neurite contenenti strutture micro-tubulari.

D) CLASSIFICAZIONE DELL’INTERNATIONAL NEUROBLASTOMA PATHOLOGY CLASSIFICATION : I.N.P.C.

I reperti istomorfologici riguardanti le cellule neuroblastiche,le cellule gangliari sono stati correlati ed integrati ai risultati del SHIMADA SYSTEM  ( vedi  cellule stromali  schwanniche) e hanno fornito all”INTERNATIONAL NEUROBLASTOMA PATHOLOGY CLASSIFICATION”   (INPC) i criteri per elaborare la seguente classificazione  (1999):
Neuroblastoma indifferenziato:
Popolazione cellulare iperdensa costituita solo da neuroblasti. Assenza di neuropilo. Le cellule schwanniche sono assenti o in numero esiguo.
Neuroblastoma scarsamente differenziato
La quota cellulare dominante è formata da neuroblasti; si reperta una componente di cellule ganglioniche mature o in corso di differenziazione inferiore al 5%.
Qualche focolaio di neuropilo. Le cellule stromali schwanniche sono assenti o sono scarsamente rappresentate.

Neuroblastoma differenziato
La popolazione dominante è data da neuroblasti, la componente ganglionica matura o in corso di maturazione è superiore al 5%.
Presenza di focolai di neuropilo. La componente di cellule schwanniche può essere assente o è rintracciabile in piccole quantità.

Ganglioblastoma nodulare
La popolazione cellulare è rappresentata da cellule gangliari mature o in corso di maturazione. Presenza di noduli circoscritti di neuroblasti residuali. Lo stroma è costituito in prevalenza da cellule schwanniche in una quantità oltre il 50%.

Ganglioblastoma intermisto
La quota cellulare dominante è costituita da elementi ganglionici maturi. Presenza di focolai di neuroblasti intermisti a cellule ganglioniche. E’ presente una cospicua componente di cellule schwanniche.

Ganglioneuroma in corso di maturazione
La popolazione cellulare è costitutita solo da cellule gangliari mature e in corso di maturazione.
Lo stroma schwannico supera quantitativamente le restanti componenti (oltre il 50%).

Ganglioneuroma maturo
La neoplasia è composta solo da cellule gangliari mature. Lo stroma schwannico supera il 50% delle componenti  stromali.

E)  INDICE DNA MEDIANTE CITOMETRIA A FLUSSO

Mediante la citometria a flusso viene calcolato su campioni tissutali di neuroblastoma l’indice di DNA per stabilire se esiste uno stato diploide oppure se è sopraggiunta una condizione di iperdiploide o ancora una situazione diploide/tetraploide.
I dati ottenuti sono inseriti nel contesto del protocollo diagnostico-prognostico poiché hanno un loro significato per stabilire il grado di aggressività biologica delle cellule neuroblastiche.

F)  INDAGINI DI GENETICA

Mediante la metodica della ibridizzazione in situ è possibile stabilire lo stato dell’Oncogene MYCN, presente nel braccio corto del cromosoma 2.
L’amplificazione di questo oncogene è associata alla presenza di cellule neuroblastiche indifferenziate o scarsamente differenziate, ad un potenziamento delle capacità proliferative e ad una accentuazione dei processi mitotico-karioressici.                           .
La determinazione dello stato di amplificazione del MYCN è utilizzata come fattore  genetico per definire la prognosi e stabilire la strategia terapeutica. Si associano altri marcatori molecolari quali la delezione del cromosoma 1p,11, la trisomia o polisomia del 17q. E’ stato accertato che il depotenziamento delle condizioni genetiche induce a esprimere un giudizio prognostico sfavorevole.

G) TNM  SYSTEM DELL’AJCC/UICC

I dati qui di seguito esposti sono quelli presenti nella classificazione elaborata dall’INTERNATIONAL NEUROBLASTOMA CLASSIFICATION  (INPC) del 1992 e inseriti nel  protocollo redatto dall’AJCC/UICC TNM  System del 2010.
Qui di seguito sono stati estrapolati  solo i parametri morfologici espressi nel suddetto TNM SYSTEM ; da tali parametri si evince  la complessità degli accertamenti diagnostici citologici e molecolari e come essi siano fondamentali  per un corretto discorso prognostico e per una efficace terapia.
Questi parametri sono così di seguito riportati:

Neuroblastoma
Ganglioneuroblastoma
Nodulare
Intermisto
Ganglioneuroma
Indeterminato
Non classificabile

Indifferenziata
Scarsamente differenziata
Differenziata
Non può essere determinata
Non applicabile

Monomorfo
Pleomorfo
Volumetria
Distribuzione della cromatina
Caratteri del nucleolo

Uninucleari
Multinucleari
Nucleo monomorfo
Nucleo pleomorfo

 

H) DESCRIZIONE DEI REPERTI DI NEUROBLASTOMA INDIFFERENZIATO E DI NEUROBLASTOMA SCARSAMENTE DIFFERENZIATO

La premessa dottrinale dianzi riportata rappresenta un riassunto a grandi linee circa la complessità delle ricerche elaborate per la conoscenza dei neuroblastomi e in particolare per   correlare i reperti morfologici con  i significati biologici delle cellule neoplastiche. Questa esposizione è stata indispenzabile per poter procedere qui di seguito a una descrizione aggiornata, ragionata,della morfo-biologia dei    neuroblastomi indifferenziati  e dei neuroblastomi scarsamente  differenziati:


1) Neuroblastoma indifferenziato

Il neuroblastoma indifferenziato è un tumore ad alta cellularità, abitualmente privo di una propria struttura; infatti le cellule sono a mutuo contatto e si dispongono in modo informe e diffuso.  Esse sono isomorfe, sono di piccola taglia, hanno forma rotondeggiante od ovalare; sono caratterizzate da un sottile orletto di citoplasma e contengono un grosso nucleo, ipercromatinico, compatto, apparentemente privo di nucleolo.

Fig.1 Fig.2
Nel contesto di tale popolazione cellulare si repertano gruppi di elementi con una maggiore quota di citoplasma e con nucleo vescicoloso pleomorfo e con nucleolo prominente.

Fig.3 Fig.4 Fig.5
Sono presenti elementi in attività mitotica e sono evidenziabili con frequenza cellule con nucleo picnotico o in carioressi.

Fig.6

Non si evidenzia in alcun campo la presenza di cellule schwanniche. La quota di stroma aspecifico può essere quantitativamente molto variabile e può svilupparsi secondo piani spaziali del tutto casuali
L’entità e la distribuzione stromale influenza e condiziona la disposizione architettonica della quota di cellule neuroblastiche. In alcuni casi lo stroma è assente oppure è limitato alle zone perivascolari con piccoli tralci che si infliggono nella massa neoplastica; in altri casi esso si sviluppa in sottili filamenti tra gruppi di cellule neoplastiche.

Fig.7 Fig.8 Fig. 9

Inoltre quando questa componente è ben sviluppata, si può disporre a rete, a travate parallele o in modo circolare delimitando così aree pseudo-nodulari o cordonali.

Fig.10 Fig.11 Fig.11bis

Fig.11ter Fig.12

Questo stroma è fornito da fasci di fibre collagene di vario spessore, da fibroblasti e ingloba capillari e spesso è sede di infiltrati flogistici linfocitare e monocitari. Non è infrequente ritrovare negli spazi interfibrillari infiltrati cellulari di elementi neuroblastici.
La componente vascolare è ben sviluppata e si distribuisce in modo casuale e disordinato. I piccoli vasi hanno pareti semplificate e sono avvolti da manicotti di tessuto collagene; i capillari sono circondati da cellule neoplastiche che, infiltrando le pareti, si riversano nel lume; in molti campi microscopicisi si ritrovano capillari quasi occlusi poiché sono tappezzati da endoteli iperplastici e pseudostratificati.
Non è infrequente l’instaurarsi di processi regressivi quali la vacuolizzazione del citoplasma, la necrosi cellulare ,le raccolte flogistiche e i focolai emorragici.

Fig.13 Fig.14
Al microscopio elettronico le cellule del neuroblastoma indifferenziato evidenziano un citoplasma povero di organuli ma ricco di ribosomi e poli ribosomi.

Fig.15

2) Neuroblastoma scarsamente differenziato 

La popolazione cellulare del neuroblastoma scarsamente differenziato appare iperdensa e pleoimorfa per la presenza di neuroblasti con iniziali gradi di differenziazione,rare cellule gangliari in corso di differenziazione e  di cellule stromali schwanniche.
La disposizione architettonica delle cellule è quella emersa nel neuroblastoma indifferenziato; anche la disposizione spaziale della quota di stroma aspecifico ripete gli stessi disegni con notevoli varianti a seconda dei casi e nel corso della loro fase di crescita .
I caratteri che definiscono questo istotipo  riguardano essenzialmente la componente cellulare  e possono essere racchiusi  nella seguente descrizione:
La componente citologica dominante è rappresentata da cellule neuroblastiche indifferenziate e commiste ad esse si repertano in quantità minori cellule neuroblastiche  voluminose fornite di discreto citoplasma intensamente eosinofilo con un nucleo vescicoloso e nucleolo prominente.

Fig.16 Fig.17
Sono presenti, in quantità molto esigua cellule più voluminose con ampio citoplasma eosinofilo, con nucleo voluminoso identificabili quali cellule gangliari in corso di maturazione.
Sono riconoscibili in diversi campi microscopici cellule stromali schwanniche che si distribuiscono negli spazi intercellulari e spesso aderiscono alle superfici esterne dei neuroblasti; molto più frequente è il riscontro in alcuni spazi intercellulari di strutture microscopiche riferibili a neuropilo.

Fig.18 Fig.19
Al microscopio elettronico gli elementi neuroblastici evidenziano un citoplasma contenente granuli di secrezione, aggregati di microtubuli ,diversi  mitocondri e strutture ergastopladmatiche;le cellule,pur essendo coese nonsono fornite di strutture giunzionali.

Fig.20