Fegato: Canalicoli biliari in epatociti vacuolari

Prof. Luigi Cuccurullo

Emerito di Anatomia Patologica dell'Università della Campania "Luigi Vanvitelli"

INTRODUZIONE                                                                    
I canalicoli biliari rappresentano la porzione più ristretta, il segmento di inizio del sistema secretore-escretore della bile.
Il lume dei canalicoli è disegnato da un duplice incavo delle membrane plasmatiche di due epatociti contigui.
Questo spazio così tratteggiato è, in effetti, delimitato da una membrana che è il continuum della membrana plasmatica appartenente ai due epatociti contigui.
Tale membrana di delimitazione nel suo percorso si ripiega su se stessa formando delle microstrutture digitiformi che sporgono nel lume dei canalicoli. Queste microstrutture, denominate microvilli, sono quasi sempre mono-assili, isomorfe, isometriche e sono costituite da una membrana di superficie e da un core occupato da microfilamenti.
Il profilo dei canalicoli è, in modo approssimativo, ovoidale; ai poli di questa figura geometrica si ritrovano strutture atte a chiudere in modo impermeabile lo spazio dei canalicoli e così separarlo nettamente dai contigui spazi inter-epatocitari.
Queste strutture di chiusura, indicate con il termine di sistema giunzionale, sono pluri-composite per la presenza di diverse subunità con differenti funzioni e così denominate: Giunzioni occludenti, Giunzioni aderenti, Gap giunzioni e Desmosomi (Br. J. Exp. Path. 1978; 59: 220-227) (Med. Electron Microsc 2003; 36: 157-164).
I canalicoli sono avvolti da sottili fasci di microfilamenti di actina, di miosina-2, di tropomiosina, di actinina  e di filamenti intermedi. Questo insieme di microfilamenti si prolungano  nei microvilli e si estendono anche alle strutture giunzionali e ai desmosomi (Am. J. Pathol. 1980; 98: 603-616) (J. Histochem. Cytochem. 1993; 41: 353-363).

Questi  microfilamenti pericanalicolari svolgono la funzione di regolare il tono dei canalicoli e indurre, con il ritmo di contrazione e decontrazione  dei canalicoli,   il deflusso dei contenuti  biliari.
In particolare,  lo svolgimento di tali funzioni richiede la integrità dei filamenti di actina e di miosina-2 (Am. J. Pathol. 1990; 136: 521-532) (J. Cell Biol. 1991; 113: 1069-1080) (J. Hepatol 2017; 66: 1231-1240),e sostegno di tale tesi è stato accertato che alterazioni di questi filamenti contrattili (dissociazione, frammentazione, riduzione) provocano disturbi delle capacità contrattili dei canalicoli.
Dopo trattamento con falloidina si ha un rimaneggiamento di actina e di miosina-2 con il risultato di ottenere a livello morfologico canalicoli collassati con lume virtuale (J. Histochem. Cytochem 1993; 41: 353-363). In tale ricerca sperimentale, i filamenti di actina e miosina-2 si sono trasformati in piccoli aggregati omogenei, mentre i filamenti intermedi (non contrattili) appaiono indenni.
Questi ultimi (i filamenti intermedi, privi di capacità contrattile) svolgono le funzioni di stabilizzare la morfologia dei canalicoli in cooperazione con le fibrille del citoscheletro degli epatociti che in sede pericanalicolare sono iperplastiche.  (Br. J. Exp. Path. 1978; 59: 220-227) (Am. J. Pathol. 1990; 136: 521-532) (Hepathology 1995; 21: 1106-1113).
L’integrità dei filamenti contrattili in uno con i filamenti intermedi correlati alle fibrille del citoscheletro,con le estensioni di queste componenti ai sistemi giunzionali e ai desmosomi, consentono la integrità morfologica dei canalicoli e una continua funzione contrattile ritmica, equilibrata e uniforme su tutta la circonferenza dei canalicoli  (Gastroenterology, 2006; 131: 878-884).
In sede pericanalicolare, a ridosso dei filamenti, si ritrovano in quantità variabili vescicole unilamellari e microtubuli (J. Lipid. Res. 1995; 36; 2147-2163).
Queste vescicole non sono stanziali, ma si spostano verso il lume dei canalicoli infiltrandosi tra i filamenti, raggiungono l’apice dei microvilli, si fondono con la membrana dei canalicoli e versano il loro contenuto nel lume dei canalicoli. In questo traffico delle vescicole ruoli importanti e coadiuvanti sono svolti anche dai microtubuli (J. Of Hepatology 2005; 42: 592-603)
Le diverse molecole presenti nel liquido biliare (sali biliari, fosfolipidi, colesterolo, lipidi biliari, etc.) richiedono la integrità delle vescicole e dei microtubuli. E per  il trasporto di queste molecole lungo il percorso citoplasmatico è necessaria anche la partecipazione attiva del citosol, del citoscheletro, del sistemia  golgiano, delle cisterne del reticolo endoplasmico e  dell’apparato dell’ ergastoplasma.
La fusione delle vescicole con la membrana dei canalicoli si avvale anche di uno specifico meccanismo addizionale di trasporto rappresentato da proteine transporters, proteine che fanno parte della larga famiglia ABC (ATP binding Cassette). Questi transporters utilizzano l’energia liberata dalla idrolisi dell’ATP e provvedono al trasporto di specifiche molecole nel lume dei canalicoli. (Am. J. Physiol. 1997; 272: G1285-G1303) (J. Of Hepatology 2005; 42: 592-603).
Pertanto la disfunzione di uno di questo insieme di proteine provoca in via transitoria o in modo definitivo una riduzione o un blocco della attività secretiva. (J. Lipid. Res. 1988; 29: 144-156) (Int. Rev. Cytol 1992; 135: 269-313) (Gastroenterology 1993; 105: 889-900) (Semin. Liver. Dis. 1996; 16: 169-189) (J. of Hepatology 2005; 42: 592-603) (Methods Mol. Biol. 2009; 519: 273-289).

In breve, è possibile affermare che I canalicoli sono strutture complesse caratterizzate da due componenti ben definite e finalizzate ciascuna con una ben precisa funzione:  La componente data dai filamenti provvede alle attività contrattili-escretrici, quella delle vescicole ,dei microtubuli e dei transporters è deputata alle funzioni  secretive.
I canalicoli, sebbene siano strutture ben definite sul piano morfologico e su quello funzionale fanno parte integrante degli epatociti. Essi sono circondati da tutti gli organelli degli epatociti,ne sono contestuali e ,interattivi; realtà questa, dimostrabile in condizioni normali e  ben evidente in situazioni di patologia.
Pertanto una valutazione morfologica su lo stato dei canalicoli non sempre può essere circoscritta a essi, bensì deve coinvolgere le zone citoplasmatiche circostanti. Quindi in molte situazioni di fisiologia e di patologia è opportuno parlare non di canalicoli, ma di polo biliare degli epatociti.

DESCRIZIONE DEI REPERTI

E’ stato ritenuto opportuno ricercare e descrivere  i caratteri ultrastrutturali dei canalicoli biliari non alterati da processi patologici diretti o indiretti  e utilizzare questi dati come base di confronto con i canalicoli coinvolti in processi patologici. I primi sono considerati “normali” e in modo convenzionale sono denominati  canalicoli “standard”.
Pertanto, è necessario procedere prima alla descrizione dei caratteri dei canalicoli considerati standard e su tale  base confrontare le alterazioni dei canalicoli nel contesto e nel corso di un processo patologico intra-epatocitario.
Per tale confronto,è stata scelta una forma di patologia relativamente semplice quale la degenerazione idropico-vacuolare degli epatociti,denominata degenerazione vacuolare.
I presenti reperti sono stati ricavati da casi di epatite B inattiva di grado minimo (ex portite, ex epatite persistente) con assenza di necrosi focale, di apoptosi, di corpi acidofili, di epatociti a vetro smerigliato, di foci di colestasi. Le lamine epatiche sono monostratificate e sono costeggiate da strutture sinusoidali nei limiti della norma
A tale scopo sono stati selezionati (mediante sezioni semifini colorate con blu di Toluidina) casi  costituiti  da epatociti ben conformati ed altri caratterizzati da epatociti rigonfi, ipodensi, vacuolizzati, aventi i caratteri morfologici della degenerazione idropica balloniforme.

I canalicoli considerati “standard” hanno una forma approssimativa ovoidale; ai poli di questa figura geometrica si trovano i sistemi giunzionali atti a separare lo spazio interno dei canalicoli da quelli contigui  inter-epatocitari
Il profilo dei canalicoli è tracciato da una membrana che  si introflette nel lume dei canalicoli formando piccoli proiezioni indicate come “microvilli”. Questi  sono monassili, hanno un aspetto cilindrico-digitiforme e sono formati da una membrana di superficie e da un core occupato da microfilamenti.

Fig.1 Fig.2
I canalicoli sono avvolti da fasci di microfilamenti che seguendo il percorso della membrana di contorno si introflettono anch’essi nei microvilli; inoltre, tali strutture, staccandosi dalla parete dei canalicoli  si prolungano fino ai sistemi giunzionali, pervadendoli.
In sede pericanalicolare si ritrovano in quantità variabili, a seconda delle attività metaboliche degli epatociti, vescicole unilamellari, microtubuli, reticolo endoplasmico, ergastoplasma, mitocondri, lisosomi primari e secondari, perossisomi, proteine del citosol e quote cospicue di fibrille del citoscheletro.
In particolare, le vescicole unilamellari si attestano, numerose, a ridosso dei microfilamenti e nel loro dinamismo li infiltrano, si spostano lungo i microvilli, si fondono con la membrana dei canalicoli e riversano nel lume il loro contenuto; non è infrequente in canalicoli apparentemente integri repertare nello loro spazio ,accanto a prodotti biliari,  vescicole unilamellari integre.

Fig.3 Fig.4
Non è attuabile una valutazione quantitativa del lume dei canalicoli,così pure della lunghezza e diametro dei microvilli per la esistenza delle attività contrattili e  secretive;  quest’ultime sono   correlata alle quote e al dinamismo delle vescicole unilamellari che, a loro volta, sono dipendenti dagli stati di fisio-patologia degli epatociti.

Il quadro morfologico degli epatociti vacuolari si manifesta secondo vari gradi, in rapporto alla gravità del rigonfiamento idropico e della compromissione degli organelli.
Questa variabilità di stati ha suggerito,per necessità descrittive, di esporre il materiale osservato in tre diversi paragrafi  in rapporto ai gradi di compromissione degli organelli citoplasmatici.

Gli epatociti sono aumentati di volume, il citosol appare ipodenso-diafano, le cisterne del reticolo endoplasmico si presentano dilatate e apparentemente prive di contenuti, i mitocondri sono rigonfi. Nell’insieme la architettura citoplasmatica si manifesta conservata.
I canalicoli, sebbene siano compressi ab-extrinseco dalla maggiore volumetria degli epatociti e siano sottoposti a un maggior flusso di liquidi, conservano la loro morfologia ultrastrutturale standard.

Fig.5 Fig.6

Nel rigonfiamento vacuolare valutato di medio grado, gli epatociti sono voluminosi, il citosol è diafano e sede di ampi vacuoli; le membrane dell’ergastoplasma sono spezzettate, le cisterne del reticolo endoplasmico sono notevolmente dilatate, i mitocondri sono rigonfi con frammentazione delle creste, le fibrille del citoscheletro sono destrutturate.
I canalicoli sono coinvolti in tale processo degenerativo, hanno subìto compressione e deformazione del loro profilo. In particolare, si rileva la presenza di microvacuoli a livello dei microfilamenti pericanalicolari e, in associazione, si osserva il rigonfiamento, la deformazione, la vacuolizzazione dei microvilli. In molti campi, i microfilamenti hanno perduto la loro continuità strutturale e la loro disposizione a fasci in conseguenza di frammentazioni e di perdita di coesione.

Fig.7 Fig.8

Fig.9 Fig.10

Fig.11 Fig.12

Fig.13 Fig.14

Nel rigonfiamento vacuolare di alto grado gli epatociti sono sedi di numerosi vacuoli ampi e spesso confluenti; le cisterne del reticolo endoplasmico sono  dilatate e frequentemente hanno perso i loro contorni per rottura delle proprie membrane. I mitocondri sono rigonfi, diafani e privi di creste. L’ergastoplasma è privo di ribosomi e appare frammentato. Le fibrille del citoscheletro sono spezzettate o sono aggregate in modo disordinato.
I canalicoli sono gravemente alterati in tutte le loro sub-strutture. I microfilamenti pericanalicolari sono frammentati, dissociati, atrofici fino alla loro scomparsa; frequentemente,perdono la loro individualità morfologica e per fenomeni di coalescenza,appaiono uniformemente compatti. I microvilli sono rigonfi, vacuolizzati,e privi di filamenti; in molti campi è possibile rilevare la erosione della loro membrana di superficie o la loro lisi. Il lume dei canalicoli non mostra la presenza di materiale biliare ma è occupato frequentemente da materiale amorfo-granuloso, quale prodotto da processi di necrobiosi.

Fig.15 Fig.16

In molti campi  i canalicoli mostrano una grave deformazione del loro profilo, hanno la membrana di contorno assottigliata o sede di micro lacerazioni con conseguente sconfinamento degli organelli pericanalicolari nel loro lume.

Fig.17 Fig.18

Fig.19 Fig.20

Fig.21 Fig.22

Fig.23

Infine, se il citoplasma degli epatociti appare sconvolto da una grave degenerazione idropica fino alla destrutturazione degli organelli, i canalicoli sono coinvolti nel processo degenerativo-litico con disintegrazione del sistema giunzionale e perdita della loro identità morfologica.

Fig.24 Fig.25

COMMENTO
Come si evince da una estesa quanto consolidata letteratura,mediante le metodiche di microscopia elettronica è stato possibile descrivere l’ultrastruttura dei canalicoli in condizioni di normalità e di patologia.
Sul piano morfologico,è stata documentata la continuità della parete degli epatociti in quella dei canalicoli e come questa,per accrescere le potenziali secretive si ripiega su se stessa formando i microvilli.
E’ stato possibile fornire la spiegazione morfologica della “blood-biliary barrier” attraverso la conoscenza del sistema giunzionale,atto nelle sue articolazioni strutturali a separare in modo impermeabile il lume dei canalicoli dagli spazi inter-epatocitari.
Ha reso comprensibile la stabilità morfologica dei canalicoli attraverso la identificazione di un apparato di sostegno costituito da filamenti intermedi e dal citoscheletro.
Ha ritrovato nei microfilamenti pericanalicolari e in quelli dei microvilli il dinamismo dei canalicoli attraverso il quale si favorisce la secrezione e soprattutto il deflusso della bile.
Ha permesso di seguire il percorso delle vescicole unilamellari e dei microtubuli dalle zone pericanalicolri fino all’apice dei microvilli e attraverso questi dati ha permesso di conoscere le modalità delle attività secretive dei canalicoli.
Attraverso la rassegna degli organelli presenti nelle zone pericanalicolari con la loro integrazione con le funzioni secretrici dei canalicoli ha forniti ulteriori giustificazioni per parlare in modo sistematico non di canalicoli ma di polo biliare.
Quale esempio circa la possibilità di conoscere le fini alterazioni dei canalicoli in situazioni di varia patologia,è stato ritenuto opportuno prendere in considerazione un quadro morfopatologico molto semplice quale quello della degenerazione idropica balloniforme degli epatociti.
E’ stato rilevato che le alterazioni dei canalicoli sono strettamente correlate alla gravità della degenerazione idropica.
Infatti,nella degenerazione idropica di lieve grado,i canalicoli appaiono nell’insieme normo-strutturati.
I quella di medio grado,si evidenzia una grave compromissione dell’apparato contrattile dei canalicoli per dissociazione e frammentazione dei microfilamenti pericanalicolari e di quelli dei microvilli.
Infine,in quella di alto grado,si riscontrano alterazioni di tutte le strutture dei canalicoli con lisi del sistema giunzionale e perdita della configurazione dei canalicoli.